Ученые расшифровали структуру светящегося вещества, содержащегося в сибирских червях

Странные биолюминесцентные организмы были обнаружены практически случайно во время вечерней работы на биостанции Красноярского государственного университета еще в 80-х годах. Тогда будущие авторы открытия, заинтересовавшись необычным свечением под ногами, нашли в земле небольших белесых червей. Приглашенный специалист из московского Института эволюционной морфологиии и экологии животных им. Северцова РАН установила новизну вида. Сибирские черви получили свое имя - Fridericia heliota (Фридериция Хелиота).

"Мы опубликовали краткое описание нового вида в 1990 году и оставили эту тему на многие годы. В конце 90-х годов мы решили подробнее изучить этих червей, но не ожидали, что это окажется так сложно, - рассказывает научный сотрудник лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН кандидат биологических наук Наталья Родионова. - Изначально предполагали, что люминесценция Fridericia heliota будет такой же, как у обитающего в США уже изученного крупного червя Diplocardia longa. Ведь его система в то время считалась классической и общей для всех светящихся червей в мире. Но оказалось, что сибирская Фридериция, в отличие от своих собратьев, при возбуждении не выделяет люминесцентную слизь, а имеет светящиеся точки, расположенные рядами на каждом сегменте. Эта уникальность нас заинтересовала, и мы решили исследовать все в подробностях. В 2003 году вместе с итальянским специалистом по червям Эмилией Рота сделали полное описание этого вида, дальше нужно было выяснить, как же все-таки он светится".

"Биохимический этап исследований мы начали с разделения биолюминесцентной системы на фермент и субстрат, то есть на люциферазу и люциферин, - уточнил старший научный сотрудник этой же лаборатории, кандидат биологических наук Валентин Петушков. - Люциферин - малая молекула, которая, окисляясь, обеспечивает реакцию энергией, вследствие чего и происходит излучение на люциферазе. Долгое время у нас это не получалось, пока не обнаружили, что система АТФ-зависима, то есть для реакции еще нужны аденозинтрифосфорная кислота и ионы магния. Подобное есть у светляков, но результаты исследований подтвердили уникальность биолюминесценции сибирского червя".

Ученые смогли очистить люциферин до практически гомогенного состояния и получить его ультрафиолетовый спектр в 2006 году. Поиск по базам данных не дал никаких результатов: не было найдено ничего похожего, сообщает copah.info. Однако, по словам специалистов, выделенного из червей люциферина было слишком мало для определения его химической природы даже самыми современными методами: в червях его содержится всего 0,1 мкг на грамм биомассы. Для исследования люминесцентных систем всегда нужно большое количество материала, а Fridericia heliota - очень маленькие (длиной всего 15-20 мм и весом около 2 мг).

"Мы сами ходили в леса и на болота, где водятся Фридериции, и собирали, - рассказывает Родионова. - Причем они оказались привередливыми: не во всяком лесу их можно найти, а размножаться в культуре они вообще отказались. Сначала мы приходили ночью, когда заметно свечение, отмечали эти места, а потом уже днем набирали почву, закладывая на зиму в контейнерах несколько тонн для последующей выборки. В лаборатории нужно было отделить "сорных" особей (тех, которые не светятся, но внешне очень похожи). Из года в год - тысячи, десятки тысяч червей - тяжелая, кропотливая работа". Позже Петушков обратил внимание, что в многостадийном процессе очистки люциферина рядом с ним держатся вещества-спутники: отделить их удается лишь на заключительном этапе. Кроме похожих хроматографических характеристик, сходными с люцифериновым оказались и УФ-спектры этих веществ, что позволило предположить и схожесть их структур. Их содержание в биомассе в десятки раз выше, чем люциферина, и ученые решили сначала расшифровать их в качестве моделей для дальнейшей работы.

В 2011 году Сибирский федеральный университет выиграл мегагрант на создание Лаборатории биолюминесцентных биотехнологий под руководством нобелевского лауреата Осаму Шимомура. Ученые получили возможность значительно продвинуться в своих изысканиях, получив современное оборудование. В итоге было собрано 90 г биомассы червей - почти 100 тыс. особей. Из этого количества удалось получить 5 мкг чистого люциферина.

"Из столь малого количества вещества удалось снять масс-спектры высокого разрешения, позволившие рассчитать брутто-формулу люциферина - C23H29N3O11, а также часть ЯМР-спектров, по которым расшифровали три фрагмента: остатки лизина, γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и уже расшифрованного ранее Компонента Х. Эту работу сделали московские коллеги Максим Дубинный и Вадим Кублицкий. Суммировав все имеющиеся данные, им удалось вычислить четвертый фрагмент молекулы - остаток щавелевой кислоты (оксалата). Пазл сложился. Однако существует десяток способов собрать пептид из этих четырех составляющих. Синтезировать все 10 - это год работы. Тогда Максим Дубинный дополнительно снял 1H ЯМР-спектры при разных значениях рН, по результатам понял, что обе карбоксильные группы Компонента X участвуют в образовании пептидной связи, а карбоксилы лизина и ГАМК свободны. Это был второй ключевой момент в работе, который позволил сократить варианты "сборки" молекулы до четырех, различающихся порядком пептидных связей при соединении фрагментов. Группа химиков-синтетиков под руководством Ильи Ямпольского синтезировала все четыре. Один из них и оказался искомым люциферином - при добавлении его к реакционной смеси с люциферазой Fridericia heliota зарегистрировали световой сигнал. Мы проверили соответствие синтезированного варианта природному и доказали их идентичность", - подытожил Валентин Петушков, добавив, что исследование биолюминесценции имеет не только фундаментальную, но и прикладную ценность.

По словам ученых, биолюминесцентный метод анализа сравним по точности с радиоизотопным - можно детектировать практически отдельные молекулы: "Новый люциферин имеет отличные шансы занять свою нишу в этой области. Во-первых, он прост в химическом синтезе: любая группа профессиональных химиков сделает такой же примерно за месяц. Во-вторых, люциферин Fridericia heliota исключительно стабилен: при комнатной температуре в водном растворе он сохраняет свою активность годами. И в-третьих, он не токсичен".

Ученые подали заявку на грант Российского научного фонда.